重庆市铂而斐细胞生物技术有限公司科研团队9月28日在Stem Cell Research & Therapy（IF=7.1）发表原创论文Therapeutic effect of three-dimensional hanging drop cultured human umbilical cord mesenchymal stem cells on osteoarthritis in rabbits报道其近期研究成果，文章揭示了三维悬滴培养的脐带间充质干细胞在治疗骨关节炎方面相较于传统方法培养的细胞具有更好的动物有效性，预示着更好的临床前景。
细胞培养是指在体外人工模拟构建生物体内环境 (无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等)，使细胞生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能。传统经典的细胞培养体系主要有两种，一种是使细胞在人工基质上单层生长 (贴壁培养)，另一种是使细胞在培养基中自由漂浮生长 (悬浮培养)。
研究人员一般会根据细胞的特性和应用目的来选择适合的培养方式，比如贴壁培养适用于大多数细胞类型，而造血细胞系则需要通过悬浮培养获得。与传统的细胞培养不同，三维 (3-dimensional，3D) 细胞培养技术是指将具有三维结构的不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养, 使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。通过3D培养，即使是最简单球体模型也能弥补单层培养的许多缺陷，比如通过模拟氧气、营养物质、代谢物和可溶信号的梯度差异，使细胞在体外保持更逼真的生化和生理反应，从而形成多样化的细胞群体，成为再生医学研究探索生物发育规律的重要工具。
骨关节炎 (OA) 是一种中老年人群高发的退行性关节疾病，且随着人口老龄化的加剧，OA发病率持续上升，严重影响社会生产力。OA目前被认为是一种复杂的多因素关节疾病，而非一种简单由关节磨损引起的经典退行性疾病。越来越多的证据表明，低度慢性炎症在OA的发病中起着重要作用。在炎症早期，免疫细胞浸润关节组织，关节内的各类细胞释放细胞因子和趋化因子，同时激活补体系统；随后，软骨细胞释放基质金属蛋白 (MMPs) 和前列腺素E2 (PGE2) 等软骨降解因子，导致细胞外基质 (ECM) 代谢失衡和不可逆的软骨降解。
间充质干细胞 (MSCs) 已被证明在OA治疗中可以促进软骨细胞再生、抑制细胞外基质降解，最重要的是MSCs可以减轻关节腔内炎性反应程度。然而，传统的贴壁培养方法（二维，2D)往往不能维持MSCs的稳定性，导致细胞衰老、细胞功能下降，最终影响MSCs治疗OA的临床疗效。本研究采用悬滴培养法将脐带来源MSCs（hUC-MSCs）培养成三维细胞球，流式细胞术检测结果显示短期三维悬滴培养不影响hUC-MSCs表面标志的表达水平。通过扫描电镜 (SEM) 观察2D与3D hUC-MSCs大体形态的差异，2D培养的细胞表面除了突起的蛋白外，整体较为光滑。3D hUC-MSCs细胞体积略小且表面比较粗糙，尤其是细胞表面有较多微绒毛状结构，有利于发挥细胞的吸收功能 (图1)。
图1. 2D hUC-MSCs和3D hUC-MSCs扫描电镜观察及表面标记物流式鉴定
本研究通过电动骨钻钻孔的方式构建实验兔后腿股骨内髁滑车软骨损伤模型。实验分为正常对照组 (无损伤无治疗)、模型对照组 (膝关节软骨缺损后经膝关节腔注射生理盐水)、2D-MSCs治疗组 (膝关节软骨缺损经膝关节腔注射2D-MSCs) 和3D-MSCs治疗组 (进行膝关节软骨缺损手术并经膝关节腔注射3D-MSCs)。术后8周取材，对缺损区域的修复组织进行肉眼观察，采用软骨组织形态学评分方法来评价软骨缺损的修复质量，通过ELISA检测关节液中炎症细胞因子的表达水平。
结果显示，术后8周模型组表面肉眼可见缺损面积较大，有退化、增生等情况；2D-MSCs治疗组软骨缺损明显减少，边界清晰，3D hUC-MSCs治疗组再生组织与周围组织结合良好，边界不明显；番红O-固绿染色定量结果显示，2D-MSCs治疗组和3D-MSCs治疗组均能明显促进软骨基质的形成，3D-MSCs治疗组的胶原纤维含量高于2D-MSCs治疗组，结果有显著性差异 (p < 0.05)。
与模型组相比，2D-MSCs治疗组的促炎因子TNF-α，IL-6和IL-7水平显著降低，但抗炎细胞因子的表达水平没有显着变化，而3D-MSCs治疗组促炎因子TNF-α的表达水平降低（p < 0.05），同时抗炎因子TGF-β1和IL-10显着增加（p < 0.05）。
对2D-MSCs和3D-MSCs进行转录组测序分析，3D悬滴培养法下调了细胞复制衰老相关基因tp53的表达，上调了细胞归巢相关基因cxcr4及多种黏附相关基因的表达。更重要的是，3D悬滴培养法显著提高了MSCs抗炎基因 (如tsg6、stc-1、IDO-1) 的表达。
基因本体（Gene Ontology，GO）数据库富集分析显示，与2D培养相比，3D聚集体的形成导致机械应力、细胞-细胞和细胞-ECM接触发生改变，这些因素共同调节MSCs的特性。3D hUC-MSCs中上调的基因在生物过程中富集，例如对刺激的反应 (GO:0050896)、细胞通讯 (GO:0007154) 和多细胞生物发育 (GO:0007275)。
图5. 转录组GO/KEGG富集分析结果
基因集富集分析 (GSEA)结果均显示急性期反应和类风湿关节炎通路基因集排名靠前，说明3D悬滴培养法主要上调免疫调控相关的基因，并能促进hUC-MSCs分泌趋化因子和细胞因子募集单核细胞发挥抗炎作用。
图6. 急性期反应和类风湿关节炎通路的GSEA富集图及领头亚集
在兔软骨缺损模型中，3D-MSCs在软骨再生和免疫调控方面表现出更好的潜力，3D悬滴培养的MSCs可能对治疗OA具有更好的临床有效性。本项研究成果也显示，重庆铂而斐已建立了成熟的三维细胞培养技术，该技术的建立，预示着铂而斐在软骨和骨组织再生医学、类器官构建、肿瘤生物学、神经系统疾病康复、循环和心脏系统疾病等领域具备了先进扎实的技术能力。
原文链接：https://stemcellres.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13287-024-03905-y
